《植物发育生物学实验》教学大纲
一、 课程的性质和任务
本实验课程是为高校生物类三年级本科生所开设的综合性、自主性、开放型、提高型的专业实验。
植物发育生物学在近年来取得了举世瞩目的进展。为使学生对于植物发育分子水平的研究方法和手段有一个系统的了解和认识，拟开设植物发育生物学实验课。本实验课程是以模式植物为对象，以植物细胞生物学、植物显微技术、植物离体操作、植物细胞工程、植物分子生物学、植物基因工程等一系列实验技术为支撑；以拓展学生的植物发育生物学基础理论知识、加强学生相关基本技能的训练、培养学生综合科研的素质、提高学生独立自主的科研能力等目的为主线；从细胞、组织、器官到个体水平不同层次，从开花、传粉、受精、胚胎发育、形态建成到植株形成等不同发育时段，循序渐进地开展一系列的植物发育生物学实验，使学生受到良好的实验技能的训练和知识水平的提高。
二、教学要求与教学方法
1、在实验教师的指导下，由学生自行进行实验前的准备工作，独立操作并完成实验的全过程，以激发学生的学习兴趣，调动学生的学习主动性，锻炼学生的科研动手能力。
2、在本实验课程总体规划的基础上，以小组为单位，鼓励学生积极自主地选择自己感兴趣的实验材料和实验内容，指导学生查阅资料，拟定具体的实验方案和实验手段，并加以实施，以培养学生的思维能力、创新意识和团队精神。
3、在实验过程中，借助现代化教学设备和手段，全过程展示实验方案、实验内容、实验步骤、实验要求和注意事项等方面，同时展示国内外相关研究结果和精美图片，以提高教学质量和教学水平，高效率的完成实验的全过程。
4、在实验过程中，教师注重亲临指导，学生注重实际操作；教师注重分析与解答疑难问题，学生注重实时记录实验结果、撰写实验报告、分析实验中出现的问题；教师注重随堂考核与讲评，学生注重综合实践能力的提高。
三、教学学时分配和安排
本实验课程的教学每周8学时，共计9周，合计72学时。
根据学生拟定的实验方案及实际情况，选择适当的实验内容，调整教学进度。
四、教学内容和要求
本实验课程分为三个部分。第一部分：植物花器官及雌雄配子体的发育；第二部分：植物发育相关基因的功能研究；第三部分：转基因植物的分析及鉴定。
五、具体教学内容及学时分配见下表：
周 次 |
实 验 内 容 |
学 时 |
第1-3周 |
第一部分 植物花器官及雌雄配子体的发育 |
3周，24学时 |
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主要内容包括： 花器官的发育及形态特征； 大小孢子及雌雄配子体的发育及形态特征； 花粉离体培养；成熟花粉离体萌发和花粉管生长（自主选择其中一项）； 胚胎发育及形态特征。 |
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第4-6周 |
第二部分 植物发育相关基因的功能研究 |
3周，24学时 |
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主要内容包括： 农杆菌转化拟南芥或烟草（自主选择材料）；转基因植株的抗性筛选及培养、无菌苗的移栽； 基因枪法转化植物细胞；观察某一特定蛋白的荧光定位及分布规律。 |
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第7-9周 |
第三部分 转基因植物的分析及鉴定 |
3周，24学时 |
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主要内容包括： 转基因植株GUS活性检测； 植物总DNA的提取、酶切和电泳；Southern杂交； 植物总RNA的提取和电泳；Northern杂交（自主选择）； 转基因植株的外部形态、细胞和组织结构的鉴定； 转基因植株与野生型植株的生长和发育状况。 |
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共 计 |
72学时 |
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随堂进行 |
撰写实验报告 成绩考核与评定 |
第一部分：植物花器官及雌雄配子体的发育
被子植物的个体发育包括营养器官（根、茎、叶）的生长发育和生殖器官（花器官）的生长发育两个阶段。花器官形成、授粉、受精及胚胎发育是被子植物个体发育中极其重要的事件，它使植物个体得以遗传和延续。在这一有性生殖的过程中，发生着一系列的生理代谢、基因调控等多个层次、不同水平的时空变化，最终体现在生殖器官的形态结构、发育进程的差异。因此，学习和掌握被子植物花器官的发生及形态、大小孢子及雌雄配子体的发生与发育过程、精卵细胞的形成及特点、授粉、受精及胚胎发育等生殖发育中的基础理论知识和实际应用能力，无疑是研究和探讨有性生殖过程中关键事态分子机理的重要前提和基础。
一、 花器官的石蜡切片及冰冻切片技术
【实验目的】 通过本实验使学生了解植物组织材料的石蜡切片及冰冻切片技术。
【实验原理】石蜡切片技术是将植物材料经固定剂迅速固定，脱水剂脱去组织和细胞中的水分，再经细胞和组织透明、置换，石蜡包埋剂包埋后，通过石蜡切片机切片后，可以进行形态结构的观察、特定物质的定位观察和原位杂交。石蜡切片技术可以保持细胞和组织中原有的形态结构特征，以及固定特定抗原决定簇，有利于研究分析基因表达和蛋白质定位等方面。
冰冻切片技术是以冰冻包埋剂在低温下迅速包埋植物材料，它可以更好的保持植物细胞和组织的原有状态。冰冻切片可以缩短常规石蜡切片缓慢而复杂的处理过程，减少对样品组织结构的损伤，更好的保存生物分子的活性。同时，它具有快速、简便、易操作等特点，有利于进行细胞生物学（如免疫定位）和分子生物学（如原位杂交）的研究。
【实验内容】 植物组织材料的选取；石蜡制片技术；冰冻制片技术；切片的观察。
【实验器材】 石蜡切片机，冰冻切片机，冰箱，烘箱等。
【实验材料】 烟草花蕾
二、 花器官的发育及形态特征
【实验目的】通过本实验使学生掌握植物花器官的发育过程和形态变化特征，以及不同光照和温度条件对花器官发育的影响。
【实验原理】 花器官的发生是由植物茎端分生组织在特定的条件下由外至内或由下至上循序渐进的分化而成。光周期对于花器官的形成至关重要。同时温度对于一些植物的花器官发生产生明显的影响，如冬小麦、胡萝卜、拟南芥等。这种低温对植物开花的影响效应被称为春化作用。
【实验内容】 植物花器官的发育过程和形态特征；不同光周期条件下花器官的分化；春化作用对植物开花的影响。
【实验器材】光照培养箱，显微镜，解剖镜等。
【实验材料】 拟南芥和烟草各时期的花蕾。
三、大小孢子及雌雄配子体的发育及形态特征
【实验目的】通过本实验使学生掌握被子植物大小孢子、雌配子体（胚囊）、雄配子体（花粉）、卵细胞、中央细胞和精细胞的发育过程以及形态特征。
【实验内容】 选取学生自己固定、包埋和切片的材料，观察大小孢子、雌雄配子体和雌雄配子发育过程中的形态特征；了解活体分离胚囊技术，观察胚囊的形态特点。
【实验器材】切片机，显微镜，解剖镜，解剖工具、台式振荡器、冰箱等。
【实验材料】烟草、拟南芥、水稻等植物的石蜡和冰冻切片，烟草成熟花蕾。
四、 花粉的离体培养、离体萌发及花粉管的离体生长
【实验目的】通过本实验使学生掌握花粉的离体培养技术；观察离体花粉萌发和花粉管生长的过程；观察钙和硼离子对离体花粉萌发和花粉管生长的影响。
【实验原理】花粉在离体培养条件下可进行孢子体途径发育，形成单倍体体植株；成熟花粉在适当的体外条件下可以正常的萌发和生长，而且，一定浓度范围内的钙和硼离子在促进其萌发和生长过程中起着十分重要的作用。
【实验内容】 花粉的离体培养及植株再生；离体花粉萌发和花粉管生长；钙和硼离子对花粉萌发和花粉管生长的效应。
【实验器材】 恒温培养箱，显微镜、搅拌器、超净工作台、冰箱等。
【实验材料】 烟草、百合、油菜等幼嫩花粉（单核花粉时期）及成熟花粉。
五、胚胎发生及形态特征
【实验目的】 通过本实验使学生了解分离植物胚胎的多种方法；学习检测胚胎活力的方法；掌握被子植物胚胎发育过程，区分单子叶和双子叶植物各期胚胎发育的形态特征。
【实验原理】采用离体显微操作技术，从胚珠中分离出被子植物的各期胚胎，并在适当的培养基中保持的活力。通过显微镜观察胚胎发育的过程及形态特征；通过荧光染色法检测胚胎的生活力。
【实验内容】 观察被子植物胚胎发育过程和形态特征；分离植物胚胎技术；检测胚胎生活力；
【实验器材】解剖镜，普通显微镜，荧光显微镜，解剖工具、冰箱等。
【实验材料】 烟草和水稻授粉后各期子房，多种植物胚胎发育时期的切片。
第二部分：植物发育相关基因的功能研究
获得基因转化植物对于植物分子生物学研究来说其重要性是不言而喻的，而事实上它使植物分子生物学研究发生了突破性的变化。它对于阐明某些特异基因在植物生长和发育的特定生化或代谢途径中所起的作用，将外源基因或基因启动子连上报告基因后转入植物，可以详细地研究植物某一特定基因的时空表达，包括基因的表达量、表达部位、相关调控序列的活性及其功能的分析。在基因工程的应用领域，将抗性基因转入重要的经济作物，从长远的角度看，它可能发展成为植物遗传育种的一个重要分支。
植物基因转化涉及到三个方面，即（1）获得特定的外源基因并将其导入植物细胞，（2）外源DNA在植物基因组中的稳定整合，（3）转基因植株的再生、筛选与鉴定，以保证外源基因在后代中的稳定表达。无论是利用转化载体还是裸露的DNA、克隆的目的基因还是非特异的DNA序列，转化方法中最重要的因素是从细胞中再生出可育的转基因植株。因此，转化成功与否以及转化效率的高低有赖于细胞培养体系的建立。基因转化系统大体可以分为两类：一类是由载体系统介导的转化系统，在这一系统中，人们利用另一种生物（农杆菌）来实现基因的转入和整合；另一类是直接的基因转化系统，即将裸露的DNA直接转入植物细胞。因此，人们所采用的转化方法因物种的不同加以选择。
一、植物无菌苗的培养
【实验目的】 通过本实验使学生掌握植物细胞培养中的无菌操作技术和无菌苗再生技术。
【实验原理】 在植物发育生物学的研究中，特别是转基因植株的再生，需要利用植物细胞培养技术加以实现。无菌苗的培养技术是植物细胞培养技术中一种重要的实验方法，而其中最为简单和实用的方法是将植物种子经过灭菌后在适当的培养基中萌发与生长，从而得到无菌试管苗。
【实验内容】 植物生长培养基的配制和灭菌；种子的灭菌和培养；无菌苗的培养与移栽。
【实验器材】高压灭菌锅，超净工作台，光照培养箱，冰箱等。
【实验材料】 烟草种子，拟南芥种子、水稻种子等。
二、芽和根的诱导及植株再生
【实验目的】 通过本实验使学生掌握不定芽和不定根的诱导及再生技术。
【实验原理】 在合适的培养条件下，在添加一定浓度和配比的植物激素培养基中，来自烟草叶片的愈伤组织能被诱导出不定芽和不定根。
【实验内容】 培养基的配制；烟草叶片的准备和培养；各种植物激素的配制；不定芽和不定根的诱导及再生。
【实验器材】 高压灭菌锅，超净工作台，光照培养箱，冰箱等。
【实验材料】 烟草无菌苗，拟南芥无菌苗。
三、 通过根瘤农杆菌转化拟南芥
【实验目的】 通过本实验使学生掌握农杆菌转化拟南芥的方法；掌握转基因植株种子的抗性筛选方法；学习拟南芥的杂交技术。
【实验原理】采用的拟南芥转化方法是floral dip的方法（Clough and Bent，1998）。将刚开花的拟南芥倒置于含有目的基因的农杆菌转化介质中，浸泡30秒左右即可。也可以直接用喷雾器将含有农杆菌的转化介质均匀的喷洒到拟南芥的花上。
【实验内容】 农杆菌转化拟南芥；转基因植株种子的抗性筛选；拟南芥去雄和杂交。
【实验器材】 培养箱，温室等。
【实验材料】 拟南芥植株。
四、 通过根瘤农杆菌转化烟草
【实验目的】 通过本实验使学生掌握烟草的叶盘转化方法。
【实验原理】 根瘤农杆菌可以侵染受伤的植物组织。经过农杆菌侵染后的植物细胞和组织可以分化出小苗，然后通过筛选获得转基因植株。
【实验内容】农杆菌转化烟草叶片的叶盘转化法；转基因植株的抗性筛选及培养。
【实验器材】 超净工作台、培养箱，温室等。
【实验材料】 烟草无菌试管苗。
五、 基因枪方法转化洋葱表皮细胞
【实验目的】 通过本实验使学生掌握基因枪法的原理及使用方法，即将外源基因导入洋葱表皮细胞的方法；了解GFP报告基因在分析蛋白质细胞定位方面的原理、方法和意义。
【实验原理】 基因枪法（biolistics）或者称为微粒轰击（particle bombardment）技术，是将包裹着DNA的金属微粒加速到一个很高的速度（通常需要部分真空以减少颗粒的速度损失），然后穿入植物细胞。绿色荧光蛋白GFP是从发光水母中分离的一种荧光蛋白，它在紫外或者近紫外光的激发条件下发射绿色荧光。用GFP标记蛋白进行细胞内的定位具有以下的优势：可以活体观察；检测快捷方便，且改造后的GFP有多种颜色可以选择，方便进行共定位的研究；荧光观察不需要添加额外的辅助因子，且外源的GFP也不影响细胞的生长和功能。GFP的分子量很小，当它与其他的蛋白融合后仍然保持其生物学活性，即受到紫外的激发后仍然会发出荧光。由于单独的GFP在细胞内的定位不具备特殊性，即GFP广泛地分布在细胞质、细胞核和细胞膜上，因此，某一特定蛋白与GFP的融合蛋白的定位则主要由该蛋白决定。
【实验内容】 洋葱表皮的准备；基因枪法将金粉和质粒混合物打入洋葱表皮细胞；荧光显微镜（488nm）观察某一特定蛋白的荧光定位及分布规律。
【实验器材】 光照培养箱，基因枪，荧光显微镜等。
【实验材料】洋葱，构建成功的瞬时表达载体质粒和对照质粒（各1μg）；金粉（1mg）。
第三部分 转基因植物的分析及鉴定
对于所有的植物转基因方法来说，并非100%的转化效率，所以需要从转化操作的材料中筛选出转化的植株、组织或细胞。在一般情况下，通过在导入的基因构件中加入一个选择标记基因来实现初步的筛选。使用最多的选择性标记基因是编码抗生素或除草剂的抗性基因。同时，在转基因过程中，报告基因的应用使目的基因的表达和定位的分析变得简单。常用的报告基因有gusA (uidA，葡萄糖醛酸糖苷酸酶基因)、lacZ（β-半乳糖苷酶基因）、luc（萤火虫荧光素酶基因）和gfp (绿色荧光蛋白基因)等。 同时，对于确定某一植株是否为转化的植株还需要证明外源DNA确实整合到了植物的基因组中。通常使用Southern杂交的方法来证明这一点，而Northern杂交的方法通常用于检测目的基因在植物中的表达情况。在转基因植物中，这种方法可以检测外源导入的基因是否在转基因植株中稳定表达、表达量以及不同部位的表达情况等。
对于转基因植株表现型的观察不仅包括简单的外部形态变化，即根、茎、叶和花器官的形态特征、生长速率以及植株形态的变化，还包括细胞和组织水平上的形态和结构以及不同环境条件刺激下，转基因植株的生长和发育状况。因此，进行详细地表现型观察对于揭示转基因植株中外源基因的功能是非常必要的。
一、 转基因植株中GUS活性检测
【实验目的】通过本实验使学生掌握植物组织中GUS染色的原理和方法。
【实验原理】在稳定转化的植株中，利用一个简单的组织化学检测就可以精确地分析gusA (uidA)融合基因的时空表达模式。用X-gluc（Biosynth）作为底物可以进行GUS活性在植物组织和细胞中的精确定位。gusA（uidA）表达的产物为葡萄糖醛酸糖苷酸酶，该酶可以切割底物（X-gluc）中的葡糖醛酸部分，从而产生无色的吲哚氧基中间产物，随后吲哚氧基中间产物氧化成为不溶的蓝色沉淀。在显微镜下出现蓝色沉淀物的分布，表明GUS融合的蛋白在转基因植株细胞和组织中的表达。用GUS进行这类实验有如下优点：（1）在大多数植物组织中GUS活性的本底低；（2）反应产物不扩散，仅在表达基因的植物细胞内积累；（3）通过简单的扩散或真空渗入，底物易被植物细胞吸收。当然，也存在一些缺点：（1）对于活体组织不太合适；（2）由于酶和产物非常稳定，因而不能真实地反映出GUS替代的某种蛋白在稳定状态下的表达丰度；（3）检测结果并非是定量的。用于染色的植物材料的制备方法需因涉及的特定组织和器官的不同而异。例如拟南芥的根、花和叶片以及烟草幼苗的根可以不做任何预处理而直接染色。但是，像烟草和马铃薯这些植物的茎和叶就必须在染色前切成薄片（1-3mm），有时特别是当操作较大的组织样品时更需如此。然而，采用真空渗入法会提高染色效果。
【实验内容】 转基因拟南芥营养器官（根、茎、叶）和花中GUS活性检测；转基因烟草叶片和花中GUS活性检测。
【实验器材】 培养箱，显微镜等。
【实验材料】 烟草和拟南芥转基因植株。
二、Southern杂交鉴定和分析外源基因在转基因植株基因组中的整合
【实验目的】 通过本实验使学生了解Southern杂交的原理和步骤；掌握植物总DNA的提取、酶切和电泳的实验方法；掌握DNA转移到尼龙膜的方法。
【实验原理】 Southern杂交用于证明外源DNA是否确实整合到转植株的基因组中。Southern杂交包括：从转化植株中提取基因组DNA，用合适的限制性内切酶进行酶切，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片断大小分离。通过毛吸管效应（Southern印迹或Southern转移）将分离后的DNA转移到尼龙膜上，然后用放射性标记的外源DNA片断作为探针，通过杂交用以检测在植物基因组中是否存在着同源序列。这项技术不仅能够检测外源DNA，而且能够估算出拷贝数。
【实验内容】 植物总DNA的提取、酶切和电泳；DNA片断转移到尼龙膜（Southern印迹）；观看教学片中有关放射性标记的实验操作步骤及注意事项。
【实验器材】 高速离心机，电泳仪和DNA凝胶电泳槽，紫外凝胶成像系统等。
【实验材料】 拟南芥转基因植株。
三、Northern杂交分析基因在植株中的表达
【实验目的】通过本实验使学生了解Northern杂交的原理和步骤；掌握植物总RNA的提取和电泳方法；掌握Northern印迹的方法。
【实验原理】RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性以及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分子分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理获得纯化、均一的总RNA。具体方法是RNA经过变性电泳分开，转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再用32P标记的探针进行杂交。Northern印迹实验用于确定RNA或poly(A)+RNA样品中某一特定ＲＮＡ的大小和丰度。
【实验内容】植物总RNA的提取和电泳；Northern印迹；
【实验器材】高速离心机，电泳仪和RNA凝胶电泳槽，紫外凝胶成像系统，同位素室，FX分子成像系统等。
【实验材料】拟南芥野生型植株及转基因植株。
四、 转基因植株的表型及细胞水平上鉴定
【实验目的】 通过本实验使学生掌握转基因植株外形观察的方法；掌握在细胞和组织水平鉴定转基因植株的方法。
【实验原理】 相对于野生型而言植株，转基因植株在外部形态、细胞和组织结构、代谢水平等方面均可能产生一定的变化。转基因植株的这些变化往往是由基因表达和细胞组织水平上的代谢变化所造成的。因此，在细胞和组织水平上对转基因植株进行深入地研究和分析是非常必要的。
【实验内容】 观察转基因植株的外形变化，包括根、茎、叶和花器官的形态特征、生长速率以及植株形态的变化等；观察转基因植株的细胞和组织形态结构的变化；在多种环境因子条件下，观察转基因植株与野生型植株的生长和发育状况。
【实验器材】 冰冻切片机，普通显微镜，荧光显微镜，冰箱，培养箱，温室等。
【实验材料】 拟南芥和烟草的转基因植株。