《生物化学技术实验》课程教学大纲
课程代码：
课程负责人：吕颂雅
课程中文名称: 《现代生物技术大实验——生物化学技术系列》
课程英文名称：Synthesis Experiment of Modern Biotechnology ---Biochemistry Serial
课程类别：选修
课程学分数：3
课程学时数：54
授课对象：第五学期学生
本课程的前导课程：分子生物学 生物化学实验
一、 教学目的（黑体五号）
该课程在内容设置上以科研课题相接轨、以完成一个阶段性实验小课题的方式，整合学生在分子生物学和生物化学实验课中所学的一些实验技术，使用现行科研中的材料、试剂、仪器和方法，形成连续性的大实验，使生化大实验和实际科研接轨，培养学生进行科研的兴趣爱好和动手能力，为学生将来进入科学研究建立一个生物化学理论知识和操作技术的平台。
该课程以蛋白质的分离、纯化和鉴定为主线，开设两个大实验模块：
第一部分、牛血清中的免疫球蛋白分离纯化及鉴定；
第二部分、细菌表达蛋白MBP－MS2的分离纯化及鉴定。
二、 教学要求（黑体五号）
第一部分实验是一个经典实验，一部分实验方法在基础生化实验中已经学习过，此实验的目的是使同学们系统连贯地掌握蛋白质分离纯化的基本技术和检测方法（蛋白质溶液的浓缩、层析分离、聚丙烯酰胺凝胶电泳测定），培养连续大实验所需要的态度、技巧、能力和素质。内容包括：
一、蛋白质溶液的浓缩和透析
二、DEAE—纤维素柱层析分离血清中的免疫球蛋白
三、聚丙烯酰胺凝胶电泳测定血清样品、透析样品、和层析分离样品
最后作总结撰写实验报告
第二部分实验是与实验室现有课题接轨，分离、纯化及鉴定细菌表达蛋白MBP－MS2。目的是使同学们掌握一种目的蛋白质目前科研所用的纯化和检测技术，培养独立科研所需要的态度、技巧、能力和素质。
MS2是一种在科研中发现的RNA结合蛋白，对RNA的折叠有作用，需要大量分离纯化。实验室的研究生构建了MBP－MS2融合蛋白表达载体，通过大肠杆菌大量诱导表达，让同学们通过目前实验室正在使用的麦芽糖亲和层析的方法分离纯化MBP－MS2蛋白，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纯度，通过Western Blot检测其正确性。纯度达到要求的样品交给实验室研究生，进入下一步实验所用。
内容包括：
一、麦芽糖亲和层析分离与纯化大肠杆菌表达蛋白MBP－MS2
二、蛋白质电泳检测分离与纯化效果
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三、蛋白质免疫印迹确定大肠杆菌表达蛋白MBP－MS2
最后总结撰写实验报告
三、 课程内容与学时分配（黑体五号）
课程内容与学时分配表
内 容 |
学 时 |
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1、血清中蛋白质的浓缩（盐析法和透析法） 2、DEAE离子交换层析分离血清中的免疫球蛋白 3、SDS－PAGE蛋白质电泳检测 |
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二、细菌表达蛋白MBP—MS2的纯化和检测 1、蛋白MBP—MS2大肠杆菌的培养、诱导和菌体破碎 2、 亲和层析分离与纯化大肠杆菌表达蛋白MBP 3、 蛋白质电泳检测分离与纯化效果 4、 蛋白质免疫印迹确定大肠杆菌表达蛋白MBP |
30 |
实验一 蛋白质溶液的浓缩
[目的要求]：掌握保有蛋白质活性的浓缩方法—盐析法的原理和技术
[实验原理]：当高浓度盐存在时，蛋白质往往凝集并析出沉淀。这一技术称为“盐析”。不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀，所以盐析常用于蛋白质的分离纯化。本实验中使用硫酸铵沉淀法沉淀血清中的蛋白质，最后使用透析法除去硫酸铵。
[教学内容]：蛋白质的盐析；蛋白质溶液的透析
[实验仪器]: 离心机，磁力搅拌器，冰箱。
实验二 离子交换柱层析
[目的要求]：了解离子交换剂的性质和用其分离免疫球蛋白的原理。初步掌握用DEAE－纤维素柱层析分离血清中免疫球蛋白实验过程的阶梯式洗脱方法。
[实验原理]：DEAE－纤维素22（DEAE－C22）是一种阴离子交换剂。免疫球蛋白在高于其等电点的pH环境中带负电荷。由于不同类型的免疫球蛋白在同一pH环境中所带的电荷量不同，它们与阴离子交换剂结合后，欲解离下来，则所需流动相的pH和离子强度是不同的。据此，改变洗脱剂的pH和离子强度，便可将各种免疫球蛋白在层析过程中分离开来。
[教学内容]：层析柱装柱、平衡；样品层析交换、洗脱；绘制分离曲线图，样品分析及鉴定。
[实验仪器]: 玻璃层析柱, 磁力搅拌器, 部分收集器, 高速冷冻离心机, 752分光光度计。
实验三 SDS－PAGE蛋白质电泳检测
[目的要求] 了解掌握SDS－PAGE蛋白质电泳原理和方法，以及在分析检测蛋白质中的应用
[实验原理] 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N—甲叉双丙烯聚酰胺（Bis）聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。
[教学内容]：SDS－PAGE胶的配制，蛋白质凝胶电泳， 电泳结果分析。
[实验仪器]: 凝胶电泳装置，电源装置，磁力搅拌器，摇床, 智能水浴锅。
*实验二、三分班连续进行（30－40 人一班），每班一周
实验四*、亲和层析
[目的要求]：了解填料的性质和用途，初步掌握用亲和层析法纯化蛋白质的技术。
[实验原理]：亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。
[教学内容]：填料选择及处理；装柱；样品洗脱；绘制分离曲线图，样品分析及鉴定。
[实验仪器]: 玻璃柱, 蠕动泵，离心机，部分收集器, 752分光光度计。
实验五*、六* 蛋白质电泳检测和印迹实验
[目的要求] 使用SDS－PAGE蛋白质电泳分析检测蛋白质纯度，掌握蛋白质印迹的原理、方法及其应用。
[实验原理] 蛋白质印迹（protein blotting）即把从电泳或层系分离的蛋白质转移到固定基质上的过程，亦称western blotting。一个典型的印迹试验包括四个步骤：① 蛋白质在固化基质上固定化；② 用非特异性、非反应活性分子封阻固化基质上未吸附蛋白质的区域，这一步被称为“封阻”（blocking）；③ 滤膜与抗靶蛋白的非标记抗体反应；④ 最后结合上的抗体可用多种二级免疫学试剂（如I125标记的抗免疫球蛋白、与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的抗免疫球蛋白）。Western印迹法可测出1-5ng的待检蛋白。
[教学内容]：蛋白质与NC膜的结合反应；抗原抗体特异性结合反应；与底物结合的显色反应；测定蛋白质的浓度或效价。
[实验仪器]: 凝胶电泳装置，电转移装置，电源装置，磁力搅拌器，恒温摇床, 智能水浴锅。
*实验四、五、六分班连续进行，每班一周。每班30-40人
四、教材与参考书
教 材：自编讲义
参考书：[1] 作者，书名（版次），出版社，出版年份（宋体五号）
[2] 作者，书名（版次），出版社，出版年份（宋体五号）
五、考核方式（黑体五号）
平时成绩：课堂表现，值日状况。占10％
实验报告：正规论文格式写实验报告：题目、作者、关键词、前言、材料方法、结果、讨论、参考文献。占90％