《生物检测技术实验》课程教学大纲
课程代码：
课程负责人：郭明雄
课程中文名称：生物检测技术实验
课程英文名称：Measurement for Biotechnique
课程类别：选修
课程学分数：1学分
课程学时数：36学时
授课对象：大学三年级学生
本课程的前导课程：普通生物学、生物化学、微生物学、普通遗传学、细胞生物学、分子生物学、免疫学等生物学基础与实验课程。
一、 教学目的
《现代生物技术大实验-4：生物检测技术》是生物技术基地班的专业课，是现代生物技术大实验板块的重要组成部分。其主要任务是使学生掌握芯片杂交、免疫荧光分析等现代生物检测技术，熟悉肝炎病毒、大肠杆菌等病原体的检测方法。另一方面，让学生掌握试剂盒研制和试剂盒评价实验的设计原理及基本方法，培养学生的初步科研的能力。为培养具有创新精神和实践能力的高素质人才奠定良好的基础。
二、 教学要求
熟悉肝炎病毒、大肠杆菌等病原体的检测方法，掌握芯片杂交、免疫荧光分析等现代生物检测技术，重点掌握芯片杂交等实验技术的主要原理。
三、 课程内容与学时分配
课程内容与学时分配表
内 容 |
学 时 |
时间分辨荧光免疫分析法检测乙肝病毒血清标志物 |
9 |
基因芯片法鉴定大肠杆菌和黄单胞菌 |
9 |
DNA杂交法鉴定转基因大豆 |
9 |
酶联TB免疫吸附实验检测试剂盒的制备及其质量评价 |
9 |
实验一 时间分辨荧光免疫分析法检测乙肝病毒血清标志物
[目的要求]
了解时间分辨荧光免疫分析仪的构造、工作原理；掌握时间分辨荧光免疫分析的检测原理；利用临床血液标本，熟悉以时间分辨荧光免疫分析法检测乙肝病毒血清标志物的操作过程。
[实验原理]
时间分辨荧光免疫分析（Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）是20世纪80年代初由Pettersson等和Eskola等创立的一种非放射性标记免疫分析技术，与传统的荧光素标记不同，它是以镧系元素，如铕（Eu）、铽（Tb）、钐（Sm）、镝（Dy）等为标记物。因此，又称为“解离－增强镧系荧光免疫分析”（dissociation-enhancement lanthanide fluoroimmunoassay，DELFIA）。
TRFIA利用了具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物为示踪物，代替荧光物质、酶、同位素和化学发光物质等，去标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，待反应体系（如：抗原抗体反应、核酸探针杂交、生物素-亲和素反应以及靶细胞对效应细胞的杀伤反应等）发生后，用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产物中的荧光强度。根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析。在通常的荧光测定中，由于测试样品中含有多种荧光成分，背景荧光（来自样品中的胶体颗粒和溶剂分子引起的散射光以及血清中蛋白质和其他化合物发出的非特异性荧光）强度大、干扰强，因此成了荧光分析法大范围推广使用的瓶颈，而TRFIA巧妙地利用了镧系元素的荧光特点：1）镧系离子螯合物的荧光衰变时间极长，是传统荧光的103～106倍；2）激发光与发射光之间的Stokes位移大，可达290nm，而普通荧光素的Stokes位移仅为28nm。这样就几乎完全消除了背景荧光的干扰，继而通过时间延迟和波长分辨，强特异性荧光和背景荧光分辨开（故称为时间分辨），使干扰达到几乎为零，成为90年代后非放射性免疫分析发展的一个新里程碑。
[实验内容]
1) 双抗体夹心时间分辨免疫荧光分析法检测待测血清样本中HBsAg含量：掌握双抗体夹心的实验原理，熟悉利用临床血液标本，以双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析仪检测乙肝病毒表面抗原的操作过程；
2) 中和抑制时间分辨免疫荧光分析法检测待测血清样本中HBeAb含量：掌握中和抑制的实验原理，熟悉利用临床血液标本，以中和抑制时间分辨荧光免疫分析仪检测乙肝病毒e抗体的操作过程。
[实验材料和用品]
1) 待检测血清、乙肝两对半检测试剂盒；
2) 所需仪器：微量移液器、离心机、振荡仪、洗板机、时间分辨荧光免疫分析仪等。
实验二 基因芯片法鉴定大肠杆菌和黄单胞菌
[目的要求]
通过微阵列基因芯片的实验，使学生对生物芯片技术的原理和方法有初步了解，并能用微阵列基因芯片进行细菌类别的鉴定，学会PCR扩增、产物检测、芯片杂交、芯片扫描和数据分析，为将来进一步使用生物芯片进行科学研究打下良好的基础。
[实验原理]
在微阵列基因芯片上印制有不同细菌的基因序列，然后通过PCR扩增这些细菌基因对应的核酸序列，并在PCR扩增过程中对PCR产物进行荧光素标记，再将标记后的PCR产物与基因芯片进行杂交；经过清洗后，用微阵列芯片进行扫描和数据分析，根据判定芯片上发生了杂交作用的基因，来推测出PCR扩增的模板中可能含有的细菌种类。
[实验内容]
采用基因芯片法鉴定大肠杆菌和黄单胞菌：主要包括细菌培养、核酸提取、探针制备、芯片制备、样品标记、杂交反应以及扫描及结果检测。
[实验材料和用品]
1) 菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、黄单胞菌（Xanthomonas campestris）；
2) 芯片：由生物芯片北京国家工程研究中心（博奥公司）提供实验用细菌类别鉴定芯片；
3) 引物：HEX荧光染料标记好的引物（由博亚生物技术有限公司或其他公司提供）；
4) 凝胶电泳相关试剂：1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；
5) 100%甲酰胺、10%SDS、20×SSC等试剂；
6) 仪器：EcoScan-100芯片扫描仪、PCR仪、水浴锅、震荡器、台式离心机等。
实验三 DNA杂交法鉴定转基因大豆
[目的要求]
本实验通过转基因植物（大豆）的鉴定，要求学生掌握分子生物学中常用的基本实验技术：如植物组织细胞的DNA提取、PCR扩增、DNA凝胶电泳、DNA杂交等等。
[实验原理]
1) DNA提取：从植物细胞中分离DNA。本次实验是从大豆细胞中得到纯化的DNA，用于做转基因植物的鉴定实验。
2) PCR扩增：把微量的DNA或RNA模板通过PCR反应进行扩增。在实验中，利用被提取的大豆DNA作为模板，用PCR技术扩增转基因植物大豆中的35S启动子。经PCR扩增后，35S条带的存在能证明被检测植物为转基因植物。
3) 电泳：一种利用电场分析DNA、蛋白质等生物大分子的实验方法。PCR完成后，利用电泳去检测PCR产物。在1956bp位置有DNA条带出现，即证明样品为转基因改造植物。
4) DNA杂交：指具有一定同源性的两条核酸单链按碱基互补原则，退火形成双链；杂交是从DNA的一级结构的层面分析DNA的方法。杂交膜上固定的35S序列做成的探针，经杂交后，薄膜上35S探针会与转基因植物中的35S序列进行杂交，通过显色反应，在相应位置上出现蓝色斑点，非转基因植物则不能。
[实验内容]
包括大豆DNA的提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物以及杂交分析PCR产物。
[实验材料和用品]
用于DNA提取的系列试剂等。
实验四 酶联TB免疫吸附实验检测试剂盒的制备及其质量评价
[目的要求]
通过ELISA方法学的建立、评价，以及试剂盒质量评价的教学，让学生正确掌握方法学评价和试剂盒评价实验的设计原理和基本方法。
[实验原理]
酶联免疫吸附实验有多种类型，常用的有间接法、夹心法和竞争法等，虽然原理不尽相同，但许多实验特点和影响因素基本一样。本实验以间接酶联免疫吸附实验检测人血清中酶联TB水平，学习酶联免疫吸附实验试剂盒的制备及其质量评价。
[实验内容]
酶联免疫吸附实验的试剂准备、酶标记抗体、包被抗原、酶联TB酶联免疫吸附实验以及试剂盒的质量评价方法介绍。
[实验材料和用品]
抗原、样本血清、酶标抗体、稀释液、洗涤液、底物溶液、终止液、酶标板、吸水纸等。
四、教材与参考书
教 材：暂无。
参考书：无。
五、考核方式
实验报告：60%
平时成绩（课堂练习、小综述及考勤等）：20%
实验结果：20%