《微生物学技术实验》课程教学大纲
课程代码：（宋体五号）
课程负责人：安志东
课程中文名称:微生物学技术实验
课程英文名称：Experiments for Microbial Technology
课程类别：选修
课程学分数：1.5学分
课程学时数：54学时
授课对象：本科三年级
本课程的前导课程：微生物学及实验，遗传学及实验，分子生物学及实验
一、 教学目的
本课程是现代生物技术大实验中的微生物学技术系列专业基础实验课，在注重专业基础性和可操作性的前提下突出先进性和系统性，加强教学内容的选择性。通过本课程的学习和实践，要求学生掌握微生物学技术以及相关领域的实验原理和方法，提高分析问题和解决问题的能力，开拓创新能力，为从事生物技术以及相关领域的科学研究工作打下基础。
二、 教学要求
调动教学双方的主观能动性，组织学生参加实验准备、设计具体实验方案，适时组织学生自采实验材料，让学生和教师共同讨论理论和实验问题。成绩评定要把学生的实际动手能力和创新精神放在重要地位。实行课堂讲授指导辅以多媒体演示。指导学生分析总结实验结果，学会正确书写科学论文。
要求学生熟悉微生物学技术以及相关领域的实验原理和方法，掌握相关的实验技巧，重点掌握微生物育种的基本方法和发酵技术。
三、 课程内容与学时分配（黑体五号）
微生物技术实验为大学本科第五学期课程，每周按6学时安排，共54学时。
课程内容与学时分配表
内 容
| 学 时
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第一部分：微生物的培养和诱变育种：营养缺陷型的诱发、检出和鉴定
| 24
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第二部分：微生物的鉴定和基因重组育种：λ噬菌体的局限性转导
| 22
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第三部分：微生物的菌种保藏和发酵：中间气单胞菌的分批发酵
| 8
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第一部分：微生物的培养和诱变育种
实验一 厌氧微生物的培养
[目的要求]
学习掌握碱性焦性没食子酸法、铁丝圈法、庖肉培养基法和厌氧罐法等厌氧微生物培养的原理和基本方法。
[实验原理]
厌氧微生物在自然界中分面广泛，种类繁多。培养厌氧微生物的技术关键是要使该类微生物处于除去了氧或氧化还原电势低的环境中。焦性没食子酸（pyrogallic acid）与碱溶液（NaOH、KOH、Na2CO3、NaHCO3）作用后生成易被氧化的碱性没食子盐，能通过氧化作用而形成黑、褐色的焦性没食子橙从而除掉密封容器中的氧。铁丝圈在酸性条件下与硫酸铜溶液起反应，在铁丝圈的表面镀上一层赤铜，在空气中极易被氧化，从而可吸收密封容器中的氧而形成厌氧环境。精瘦牛肉或猪肉经处理后配制成庖肉培养基，其中既含有易被氧化的不饱和脂肪酸能吸收氧，又含有谷胱甘肽等还原性物质可形成负氧化还原电势差，再加上将培养基煮沸驱氧以及用液体石腊（凡士林）封闭液面，可用于培养厌氧菌。利用一定方法在密封的厌氧罐中生成一定量的氢气，而经过处理的钯或铂可作为催化剂催化氢与氧化合形成水，从而除掉罐中的氧而造成厌氧环境。厌氧罐中的氢气的生成可采用钢瓶灌注的外源法，但更方便的是利用各种化学反应在罐中自行生成的内源法，例如可利用镁与氯化锌遇水后发生反应产生氢气：Mg+ZnCl2+2H2O MgCl2+Zn(OH)2+H2↑
[实验内容]
碱性焦性没食子酸法；铁丝圈厌氧法；庖肉培养基法；厌氧罐培养法等。
[实验材料和用品]
菌种：厌氧细菌。恒温培养箱, 厌氧罐, 厌氧培养箱等。
实验二 微生物的单细胞分离
[目的要求]
学习掌握微生物单细胞分离的原理：熟悉微生物单细胞分离的方法。
[实验原理]
借助一定的仪器或实验手段，在显微镜下从微生物群体中直接分离或挑取微生物单细胞或孢子至适应的培养基中，经培养即可得到该细胞或孢子的纯培养物。在一定的条件下还可利用此技术进行微生物单细胞的显微操作，如：外源细胞物质，两个特定个体间的有性、无性结合，原生质体融合等。
[教学内容]
单孢子简便分离法；用显微操纵器分离单个细胞。
[实验材料和用品]
菌种：单细胞微生物。显微操作仪等。
实验三 营养缺陷型菌株的诱发、检出和鉴定
[目的要求]
学习掌握营养缺陷型菌株诱发、检出和鉴定的原理和基本方法。
[实验原理]
从自然界得到的野生型菌株，一般都能在基本培养上生长。经物理或化学因子（或生物因子）处理后，部分野生型细胞的基因发生突变，丧失合成某种必需物质（如氨基酸、维生素、碱基等）的能力，因而不能在基本培养基中生长，只有在基本培养基中补加这种物质时才能生长。这种在营养上表现出某种缺陷的变异菌株，叫做营养缺陷型菌株。亚硝基胍（NG或NTG）是一种广泛使用的强诱变剂。它主要在DNA链的复制区引起GC→AT转换，即使在杀菌率很低的情况下也能诱发高频率的突变。
[教学内容]
NG诱变处理；营养缺陷型的检出（点种法、影印法、夹层法）；营养缺陷型的鉴定（生长谱法）。
[实验材料和用品]
菌株：谷氨酸棒杆菌T13. 恒温培养箱, 冰箱, 恒温摇床, 智能水浴锅等。
第二部分：微生物的鉴定和基因重组育种
实验四 微生物的快速鉴定和自动化分析
[目的要求]
掌握微生物的快速鉴定和自动化分析的原理和方法。
[实验原理]
如何使微生物学技术方法快速, 准确, 简易和自动化, 一直是微生物工作者研究的热点。 近20多年来, 随着微电子, 计算机, 分子生物学, 物理, 化学等先进技术向微生物学的渗透和多学科交叉, 这方面已经取得了突破性进展, 已经建立了许多快速, 准确, 敏感, 简易, 自动化的方法和技术。微量多项鉴定系统是根据微生物生理生化特征坚定的结果,而进行的数码分类鉴定。国际上广泛使用的微管简易诊断系统有API-20, Enterotube, Index, Minilek, Pathotec, R-B, Micro-ID等. 国内有E-15, SWF-A, ARB-ID。微生物自动检测仪是利用光电扫描装置测量微生物生理生化特征和药敏状况. 根据数码分类鉴定方法的原理, 进行计算机处理, 迅速全自动大引出检测的结果。该系统能够快速, 全自动对微生物同时或分别进行鉴定, 计数和药敏实验, 而且可以直接用样品检测, 不用分离出微生物再用来鉴定。PCR方法鉴定细菌的依据是核酸是生命本质的基本原理。随着现代分子生物学的迅猛发展，Woese 根据其测定的rRNA序列数据提出了三界系统理论，确定了各种微生物间的亲缘关系。通过特定引物扩增微生物基因组，可得出各种不同长度片段的谱带，与标准谱带对照，从而快速对微生物作出准确鉴定，特别是对那些不可培养微生物的鉴定有重要意义。
[教学内容]
微量多项鉴定系统; 微生物自动检测仪; PCR方法鉴定细菌等。
[实验材料和用品]
菌株：待检菌株。全自动微生物鉴定系统（Automated Identification Systems）, PCR仪，恒压电泳仪，电泳槽等。
实验五 细胞融合
[目的要求]
了解细胞融合的一般操作程序及方法，学习细菌原生质体的制备及融合技术。
[实验原理]
两个或两个以上的细胞经过自然的或者人为的作用合并成为一个细胞叫融合细胞，这个过程就称之为细胞融合过程。用微生物作材料进行细胞融合，即微生物原生质体融合，必须消除两道屏障：一是细胞壁；二是细胞膜。通常采用酶解作用破除细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。细胞膜融合之后，还须经过细胞质融合，细胞核重组，细胞壁再生等一系列过程才能形成具有生活能力的新菌株。融合后的细胞有两种可能：一是染色体DNA不发生重组，两种细胞的染色体共存于一个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合。另一类是两亲本细胞核染色体DNA真正发生重组。通过连续传代分离纯化可以区别这两类融合。应该指出，即便是真正的重组融合子，在传代中也有可能发生分离，产生回复或新的遗传重组体。因此，必须经过多次分离纯化才能够获得稳定的融合子。
[教学内容]
原生质体的制备, 原生质体再生, 原生质体融合。
[实验材料和用品]
菌株：天津短杆菌TG866. 恒温培养箱, 冰箱, 恒温摇床, 智能水浴锅, 显微镜等。
实验六 微生物质粒及表型效应
[目的要求]
学习掌握革兰氏阳性菌和真核微生物基因转移的基本原理和基本方法。理解质粒也是生物进化的重要因子及现代分子生物学发展的重要工具和手段。
[实验原理]
质粒是一种独立于染色体外，能进行自主复制的遗传因子。质粒一般对宿主是非必需的，但在某些特殊条件下，能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长的优势。质粒也象染色体一样携带编码多种遗传性状的基因，并授予宿主细胞一定的遗传特性，许多与医学，农业，工业及环境密切相关的重要微生物特征均是质粒编码的，具有重要的应用价值。质粒也是微生物进化的重要因子，及现代分子生物学发展的重要工具和手段。
质粒的表型效应主要有以下几个方面：（1）致育性，（2）产生抗菌物质和毒素，（3）对药物和重金属离子的抗性，（4）利用异常营养物，（5）对植物的致病性，（6）其它特性，如固氮，限制酶的产生和乳糖的利用等。实验主要以革兰氏阳性菌和真核微生物为受体，导入人工构建的穿梭载体及一般大肠杆菌质粒，穿梭载体可以在受体内很好复制，其携带基因也得到了表达，而一般大肠杆菌质粒则不能产生转化子，进一步强调载体的穿梭性在不同微生物间遗传操作的必要性及重要性。
[教学内容]
供体质粒（基因）向枯草芽胞杆菌的导入(电转化); 酵母菌细胞的转化(完整细胞转化法)等 。
[实验材料和用品]
菌种：大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，酿酒酵母。电脉冲仪(GenepulserTM 型电脉冲仪), 电转化杯：按其内径分为0.2cm和0.4cm 两种型号, 恒温水浴锅等。
实验七 细菌转座子的易位效应
[目的要求]
学习掌握转座子介导的插入突变的基本原理和基本方法。
[实验原理]
转座子（Tn）又称易位子，是细菌中发现的能在复制子的不同位置或不同复制子之间转移位置的某些核苷酸顺序。当一个转座子转移位置而插入某一基因时，使这一基因失活并带进转座子上的抗性基因。利用转座子可以有交地取得任何一种突变型。
[教学内容]：galE突变型细胞中积累中间产物UDP－Gal而死亡的筛选机制；细菌的接合作用；转座到特定基因中的频率测定。
[实验材料和用品]
菌株：(供)大肠杆菌Tn5 Gmid β λ，（受）大肠杆菌FD1006. 恒温培养箱, 冰箱, 恒温摇床, 智能水浴锅等。
实验八 λ噬菌体的局限性转导
[目的要求]
学习掌握λ噬菌体转导的基本原理;熟悉了解λ噬菌体局限性转导的一般程序和技术关键。
[实验原理]
一般说来，λ噬菌体只转导位置在原噬菌体两边的gal和bio等少数几个基因。携带有λ原噬菌体（该噬菌体整合在细菌染色体的gal基因附近）的溶源菌，受紫外光诱导后释放出的噬菌体颗粒中极少数（约10－6）带有邻近的gal基因，而噬菌体本身失去了部分染色体。这种噬菌体称为缺陷性半乳糖转导噬菌体（λdg），这些转导噬菌体所进行的转导称为低频转导（LFT）。用这种低频转导噬菌体裂解液以高感染复数感染另一非溶源性gal－受体菌，在λdg感染的同时，会有许多正常（辅助）噬菌体参与感染。由于前者的缺陷为后者所补偿，λdg非但能进入受体细胞，和正常λ一起整合到受体细胞染色体上去，使成双重溶源菌，而且经诱导后同样能复制并释放出约占噬菌体总数一半的具有半乳糖发酵基因能力的噬菌体。这些转导噬菌体所进行的转导称为高频转导（HFT）。
本实验拟以带有原噬菌体λ和缺陷噬菌体λdg的双重溶源菌gal＋作为供体，经紫外线诱导后，获取能转导半乳糖发酵基因的高频转导噬菌体裂解液，然后让这些转导噬菌体把gal＋基因转移到受体菌gal－中去。
[教学内容]
噬菌体裂解液的制备；噬菌体的效价滴定；转导试验（平板点滴法）；转导频率的测定及EMB糖发酵检测培养基的应用。
[实验材料和用品]
菌株：（供）大肠杆菌K12 F2 gal+,(受)大肠杆菌K12 S gal-。紫外照射装置，恒温培养箱, 冰箱, 恒温摇床, 智能水浴锅等。
第三部分：微生物的菌种保藏和发酵
实验九 微生物菌种保藏
[目的要求]
学习掌握微生物菌种保藏的原理和基本方法。
[实验原理]
为了能较长期地保持微生物菌种的特性，防止菌种的衰退和死亡，按其特性选用最佳的保藏方法，使菌种不死、不衰、不乱，以达到有利使用和交换的目的。菌种的各种变异都是在微生物的生长繁殖过程中发生的，为了防止菌种的衰变，在保藏菌种时首先要选用它们的休眠体如分子孢子、芽胞等，并要创造一个低温、干燥、缺氧、避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能较长期地维持其休眠状态。对于不产孢子的微生物来说，也要使其新陈代谢处于最低水平，又不会死亡，从而达到长期保藏的目的。常用的菌种保藏方法有斜面或半固体穿刺的冰箱保藏法、石蜡油封藏法，砂土保藏法、冷冻干燥保藏法和液氮保藏法等。无论用哪种保藏法，在进行菌种保藏之前都必须设法保证它是典型的纯培养物。
[实验内容]
常用的简易保藏法（斜面、半固体穿刺、石腊油封藏等）；沙土管保藏法；薄膜保藏法；冷冻真空干燥保藏法；液氮超低温保藏法。
[实验材料和用品]
菌种：微生物纯培养物。恒温培养箱, 冰箱, 电炉, 冷冻真空干燥箱, 真空泵, 高频电火枪等。
实验十 微生物发酵
[目的要求]
了解微生物发酵的过程。掌握小罐发酵的操作方法。
[实验原理]
微生物在控制其生长条件情况下,生长处于特定阶段,可以积累特定产物。在工业生产中主要通过控制温度和营养物质来生产产品。
[教学内容]
上罐, 补料, 发酵,绘制生长曲线图。
[实验材料和用品]
菌种：中间气单胞菌。发酵罐, 高压灭菌锅,电脑等。
四、教材与参考书
教 材：自编，生物技术实验，2006年
参考书：[1] 沈萍，微生物遗传学（第一版），武汉大学出版社， 1995
[2] 沈萍等，微生物学实验（第三版），高等教育出版社，1999
[3] 吴根福，发酵工程实验指导（第一版），高等教育出版社，2006
五、考核方式
平时成绩：70% ，包括课堂考查，实验报告。
考核成绩：30% ，包括学习态度,课堂纪律，原始记录，科学素质，实验室卫生。
