《细胞生物学实验》课程教学大纲
课程代码：
课程负责人：刘江东
课程中文名称:细胞生物学实验
课程英文名称：Experiment of Cell Biology
课程类别：必修
课程学分数：
课程学时数：54
授课对象：本科生
本课程的前导课程：普通生物学、生物化学
一、 教学目的
在我国生命科学高等教育教学中，细胞生物学被指定为主干课程之一，细胞生物学实验也是该课程的重要组成部分。通过实验，学生不仅验证了理论知识，获得了感性认识，同时也学习了基本实验技能，为今后的学习和科研奠定了基础。
二、 教学要求
熟悉细胞基本结构，掌握细胞生物学常规实验技术，重点掌握细胞器形态学、细胞遗传学、细胞化学、细胞生理、细胞培养、电镜标本制备、细胞凋亡分析、荧光原位杂交、绿色荧光蛋白表达、流式细胞分选等较新的技术和方法。
三、 课程内容与学时分配
课程内容与学时分配表
内 容
| 学 时
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几种特殊显微镜的使用
| 5
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细胞培养的准备
| 3
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原代培养
| 4
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细胞系的传代培养与观察
| 3
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放线菌素D诱导细胞凋亡的形态学观察
| 4
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细胞内过氧化物酶的显示
| 2
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细胞吞噬活动的观察 活体染色
| 3
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细胞器的观察；几种病理细胞和正常细胞的比较观察
| 4
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细胞骨架的观察
| 5
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动物细胞核和线粒体的分离
| 5
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细胞融合
| 4
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小鼠染色体制备及观察
| 5
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细胞减数分裂的观察
| 3
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DNA的细胞化学检测
| 3
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考试
| 1
|
实验一 几种特殊显微镜的使用
[目的要求]
了解几种生物学研究常用的光学显微镜，如明视野显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、偏振光显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜的构造、原理、用途和使用方法。
[实验原理]
光学显微镜作为观察研究细胞结构的基本设备，一直沿用至今。随着科学技术的发展，人类的光学显微技术获得了长足的进步，极大提高了分辨率，并且通过对其光学部件的改进，制造了适用于不同用途的多种特殊显微镜，为生命科学研究提供了有力的观察工具。因此学习各种常用显微镜的工作原理，充分发挥其特长，获得清晰的图像和良好的观察效果，对于细胞生物学研究具有重要的意义。
[实验内容]
明视野显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、偏振光显微镜、荧光显微镜
[实验材料和用品]
人血细胞涂片标本、轮藻、马铃薯、水绵、培养中的Hela细胞、载玻片、盖玻片、镊子
实验二 细胞培养的准备
[目的要求]
学习细胞培养用品的清洗、消毒方法。掌握干热灭菌法、湿热灭菌法、过滤除菌法和化学消毒法的原理和操作方法。
[实验原理]
细胞培养需要使用大量的器材，包括玻璃器皿、金属器械、塑料和橡胶制品，以及布类、纸类等。体外培养的细胞，对生长环境的洁净和无菌都有很高的要求，培养使用的塑料和玻璃容器不能残留有害物质，包括解体的微生物、细胞残余物以及非营养成分的化学物质，如有毒物质、杂质和油迹等，即使存在极微量的这些杂质，也会妨碍细胞的生长。器皿和试剂中存在的微生物在营养丰富的培养基中会大量繁殖，也会影响细胞的生长。因此组织培养中的清洗和消毒，其主要目的就是清除器皿和试剂中杂质并灭菌，确保不残留任何影响细胞生长的成分和微生物。另外，进行细胞培养工作的场所、工作台等也必须进行严格的消毒和灭菌。俗话说：良好的开始是成功的一半。细胞培养的准备工作是极为重要的步骤，直接关系到实验的成败。操作者应当建立无菌观念，掌握无菌操作技术，防止在任何环节上发生污染。
[实验内容]
练习对剪刀、镊子、烧杯、吸管、培养瓶、瓶塞、培养皿等物品的清洗、包装和灭菌。[实验材料和用品]
蒸汽灭菌锅、鼓风干燥箱、过滤器、蠕动泵、微孔滤膜（孔径0.22μm）、剪刀、镊子、小烧杯、吸管、25ml培养瓶、瓶塞、培养皿、吸管筒、袖套、牛皮纸、洗液。
实验三 原代培养
[目的要求]
学习活体取样、组织剪切、接种和恒温培养操作技术，初步掌握细胞原代培养的无菌操作技术和过程。
[实验原理]
原代培养（primary culture）是细胞从活体中(in vivo)转入离体状态下（in vitro）培养的起始步骤，通俗地说，就是第一次培养。原代培养是细胞培养的关键环节之一，许多研究都必须借助于这个方法来建立一套材料体系，获得相应的细胞系（株）或扩大它们的来源。原代培养物的优点在于：细胞刚从活体移植到离体条件下，主要的性状、结构尚未产生改变，仍为二倍体细胞，与细胞系特别是永久细胞系相比，更能反映细胞在活体中的状态。在相对稳定的条件下，用原代培养物做药物测试、细胞分化等实验效果更好。因此，原代培养是组织与细胞培养工作中必须掌握的基础技术。
[实验内容]
由于组织块能够为细胞保留习惯生长的微环境，因此细胞更容易存活下来并适应新环境和生长。通过植块培养，可以让细胞从组织块中迁移出来且在周围分裂增殖，从而获得细胞培养物，此外还可用于观察植块的组织学生长行为。
[实验材料和用品]
照蛋器、超净工作台、恒温培养箱；孵化9～11天的鸡胚、Hanks液、培养液（1640＋20%小牛血清）、已灭菌培养用品和器械[培养瓶、培养皿、吸管、胶塞、眼科剪、尖头镊子、剪刀、大镊子、小烧杯、烧杯、金属消毒筒、袖套]、酒精灯、酒精喷壶、酒精棉球、打火机、吸耳球、铅笔、记号笔、污物缸。
实验四 细胞系的传代培养与观察
[目的要求]
了解和掌握原代细胞或细胞系传代培养、冻存和复苏的原理和方法。
[实验原理]
随着培养时间的延长，原代培养获得的新生细胞不断分裂增殖，数量越来越大，逐渐占满培养器皿的底层，细胞之间因为相互接触，生长趋于缓慢甚至停止。此时，需要通过传代使培养物分割成小的群体，重新接种到培养器皿中，让细胞恢复生长，其实质就是分割后再一次培养，这个过程称为传代（passage）或者再培养（subculture）。通过传代，细胞不仅恢复了生长、增加了数量，同时来源于共同组织的细胞间的变异得以表现，经过传代、鉴别和贮存，为各种实验开拓了广泛的材料来源。
[实验内容]
HeLa细胞传代和继续培养观察。
[实验材料和用品]
超净工作台、液氮罐、细胞培养箱、离心机、恒温水浴锅、冰箱
单层培养物（Hela细胞）、Hanks液、0.25%胰蛋白酶、1640培养液（含10%小牛血清）、二甲亚砜、液氮、吸管、培养瓶、胶塞、酒精灯、塑料冻存管（玻璃冻存安瓿）、离心管、小布袋、棉线
实验五 放线菌素D诱导细胞凋亡的形态学观察
[目的要求]
观察凋亡细胞的形态变化。
[实验原理]
细胞死亡有两种形式：一种是坏死性死亡（necrosis），是由于细胞外部的化学、物理或者生物因素的侵袭而造成的细胞崩溃裂解；另外一种是凋亡（apoptosis），是细胞在一定的生理或者病理条件下按照自身的程序结束其生存，是由基因决定的自动结束生命的主动过程，是受到严格的遗传机制决定的程序性调控，所以也被称为细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）。细胞凋亡对于多细胞生物个体的胚胎发育、维持器官组织细胞数目相对平衡、自我平衡的保护以及抵御外界因素的干扰都有着重要意义。
诱导细胞发生凋亡的外在因子包括物理性因子（如紫外线、γ射线等）和化学性因子（如超氧自由基、羟自由基、视黄酸、环己亚胺、放线菌素D等）。
[实验内容]
Hochest33258荧光染料能够和DNA特异结合，对正常细胞、凋亡细胞均能染色，受到紫外光激发可发出绿色荧光。但由于凋亡细胞的染色质凝缩和凋亡小体的形成，因此呈致密浓染，而正常细胞则发出均匀荧光，由此可以将凋亡细胞和正常细胞区分开来。
[实验材料和用品]
荧光显微镜、恒温培养箱、超净工作台、离心机等；
Hela细胞、微量加样器、Eppendorf离心管、培养瓶、载玻片、盖玻片；PBS（pH7.4）、卡诺氏固定液（甲醇:冰乙酸＝3:1）、放线菌素D（1mg/ml）、Hochest33258
实验六 细胞内过氧化物酶的显示
[目的要求]
掌握联苯胺反应法显示细胞内过氧化物酶的原理和方法。
[实验原理]
细胞内的过氧化物酶可以将联苯胺氧化成蓝色或者棕色产物，蓝色为中间产物联苯胺蓝，很不稳定，可自然转变为棕色的联苯胺腙，通过产物颜色间接显示出细胞内过氧化物酶的分布。
[实验内容]
骨髓细胞内可以见到蓝色或者棕色的颗粒，即过氧化物酶所在的部位。
[实验材料和用品]
光学显微镜；小白鼠、剪刀、镊子、载玻片、牙签、吸管。
0.5% CuSO4、联苯胺混合液、1%番红
实验七 细胞吞噬活动的观察 活体染色
[目的要求]
观察巨噬细胞吞噬外源细胞的过程，了解吞噬作用在非特异免疫中的作用；掌握一般活体染色的原理和方法。
[实验原理]
在高等动物体内，嗜中性粒细胞和单核吞噬细胞系统具有吞噬功能，是机体非特异性免疫的重要组成部分。嗜中性粒细胞主要分布于外周血中，具有高度的移动性和吞噬功能，在异物入侵和炎症早期，该类细胞从血管渗出，游走到局部，吞噬异物和病原体；单核吞噬细胞系统包括单核细胞和巨噬细胞，其中单核细胞来源于骨髓干细胞，在骨髓中形成后进入血液，通过毛细血管进入肝、脾、淋巴结和结缔组织，进一步分化成为巨噬细胞。巨噬细胞具有较大的体积，表面具有伪足而呈多形性，可以向病源或异物游走，伸出伪足将其包围内吞，形成吞噬泡，然后通过与初级溶酶体融合，将异物分解掉。巨噬细胞只有在活化后才有较强的吞噬功能，因此先对实验动物腹腔注射淀粉进行免疫，几天后才能较好地观察到吞噬细胞对外源细胞的吞噬现象。
[实验内容]
小鼠腹腔免疫注射，提取腹腔液，制片观察巨噬细胞吞噬外源细胞行为。
[实验材料和用品]
光学显微镜；注射器、载玻片、盖玻片、吸管、剪刀、镊子、试管。小白鼠、1%鸡红细胞悬液、3%淀粉溶液（含0.4%台盼蓝）、生理盐水。
实验八 细胞器的观察；几种病理细胞和正常细胞的比较观察
[目的要求]
观察几种细胞器；观察正常和癌变的胃组织、肝组织、肺组织切片。
[实验原理]
高尔基体（Golgi body）又称高尔基复合体（Golgi complex），是意大利科学家Golgi在1898年发现的只存在于真核细胞中的一种细胞器。它与细胞的分泌功能密切相关，能够收集和排出内质网合成的物质，参与糖蛋白和黏多糖的合成，同时也是聚集某些酶原颗粒的场所。高尔基体由平行排列的扁平膜囊、液泡和小泡等结构组成，在不同的生物体细胞中，其数量有较大区别，少则数个，多则上万。尤其在分泌功能旺盛的细胞中（如唾液腺细胞、胰腺外分泌细胞、上皮细胞等），数量巨大。
中心体是动物细胞和某些低等植物细胞中的一种细胞器，一般在细胞进行有丝分裂的时候才能较清楚地被观察到，它位于细胞的两极，呈小圆点状，可由一到两个中心粒所构成。中心体易被碱性染料（如苏木精、卡红、沙黄、结晶紫等）着色，尤以铁苏木精效果较好。
线粒体（mitochondria）是细胞内进行氧化磷酸化和形成ATP的主要场所，其外形多种多样，一般呈线状、短线状或者粒状。在不同类型的细胞中，线粒体的数目相差悬殊，少的只有几个，多的可达数千个。线粒体在细胞质中的分布也是不均匀的，常常集中在代谢活跃的区域。
癌细胞往往具有异型性，在组织切片中容易识别。
[实验内容]
用明视野显微镜对玻片标本进行观察，先用低倍镜寻找目标，再用高倍镜观察细节。
[实验材料和用品]
明视野显微镜；犬（兔）神经节切片（示高尔基体）、蛙肝切片（示线粒体）、马蛔虫受精卵切片（示中心体）、正常和癌变的胃组织、肝组织、肺组织切片。
实验九 细胞骨架的观察
[目的要求]
掌握用考马斯亮蓝R250（Coomassie blue R250）染色法、罗丹明标记的鬼笔环肽（Rhodamine－Phalloidin）染色法和间接免疫荧光法观察动物和植物细胞骨架的方法。
[实验原理]
细胞骨架(Cytoskeleton)是发现较晚的细胞器，是细胞内以蛋白纤维为主要成分的网络结构，主要包括微管（microtubule，MT）、微丝（microfilament，MF）和中间纤维（intermediate filament，IF）以及核骨架（nucleoskeleton）-核纤层（nuclear lamina）体系。微管主要分布在核周围，呈放射状向四周扩散，微丝主要分布于细胞质膜的内侧，而中间纤维则分布在整个细胞中。细胞骨架具有维持细胞形态结构和内部结构的有序性、参与细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递和细胞分裂等重要功能，因此对细胞骨架的研究也是近代细胞生物学中最活跃的领域之一。通常使用免疫荧光、电视显微镜和电子显微镜观察等方法对细胞骨架进行研究。
[实验内容]
考马司亮兰R250染色法、荧光素标记的鬼笔环肽染色法、间接免疫荧光法等。
[实验材料和用品]
光学显微镜；
烧杯、吸管、镊子、玻片染色缸、载玻片、盖玻片；
新鲜洋葱鳞茎、6mM磷酸盐缓冲液（pH6.8,用NaHCO3调节）、M缓冲液、1%Triton X-100（用M缓冲液配制）、0.2%考马斯亮蓝R250（配制溶剂为甲醇:冰乙酸:水＝46.5:7:46.5）、3%戊二醛（用6 mmol/L 磷酸盐缓冲液配制）、50%,70%,95%乙醇。
实验十 动物细胞核和线粒体的分离
[目的要求]
了解用细胞匀浆和差速离心分级分离细胞组分的原理及方法。
[实验原理]
差速离心法（differential centrifugation）是在均一的介质中先用较低的离心速度对混合物进行离心，使较大的颗粒先沉淀下来，再用较高的转速将原先悬浮于上清液中的较小颗粒沉淀下来，从而使各种亚细胞组分得以分离，如图8-1所示。本实验分离细胞核和线粒体就是采用此法。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时是均匀分布于整个离心管中的，故每次分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。
[实验内容]
差速度离心法分离动物细胞核和线粒体。
[实验材料和用品]
光学显微镜、普通离心机、台式高速离心机、玻璃匀浆器、普通天平、载玻片、盖玻片、离心管、Eppendorf离心管、吸管、解剖剪、镊子、吸水纸、八层纱布块或尼龙网（200目）、冰块、记号笔。0.25 mol/L蔗糖水溶液（含0.003 mol/L氯化钙）、詹纳斯绿B染液、95%乙醇、吉姆萨染液、大白鼠。
实验十一 细胞融合
[目的要求]
了解细胞融合实验的操作原理和方法，观察融合过程中细胞的行为和变化。
[实验原理]
随着科技的发展，细胞融合技术日臻完善，不仅可以将不同种、属、科、目的动物的细胞融合，甚至还可以将动物细胞与植物细胞进行融合。目前，该技术广泛应用于研究核质关系、绘制染色体基因图谱、研究肿瘤发生机制等，在生产实践方面，被应用于制备单克隆抗体，为免疫学研究开辟了一条崭新的研究途径。目前，人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融合和电激诱导融合。
[实验内容]
化学融合法和电击融合法促使动物细胞融合。
[实验材料和用品]
显微镜、离心机、恒温水浴锅、电融合仪；
鸡血红细胞、Hela细胞、血球计数器、血球计数板、擦镜纸、吸水纸、量筒、酒精灯、滴管、离心管、注射器、载玻片、盖玻片、烧杯；
50%PEG、8%PEG、Hanks液、Alsever’s血细胞保存液、0.6mol/L蔗糖溶液、GKN溶液、0.85%生理盐水。
实验十二小鼠染色体制备及观察
[目的要求]
初步掌握动物骨髓细胞染色体制备的基本方法；观察小鼠骨髓细胞染色体的形态与数目。
[实验原理]
染色质（chromatin）的成分为DNA和蛋白质的复合体，是遗传信息的载体，一般呈丝状，只有在细胞分裂经过期高度螺旋化和包装，形成染色体（chromosome）后，才能在光镜下进行形态观察和各种分子细胞遗传学分析（如CGH、FISH等）。用动物细胞制备染色体标本，关键是确保一定数量的细胞处于分裂期。对于外周血细胞或者其他组织细胞往往要通过细胞、组织培养来获得较多的分裂细胞，而在动物骨髓细胞中，有丝分裂行为旺盛，因此，利用骨髓细胞为材料，经过纺锤体抑制剂处理后，可以使较多的细胞停留在有丝分裂中期。动物染色体标本的制备一般包括纺锤体抑制剂处理、低渗、固定、制片、染色等步骤。
[实验内容]
制备小鼠骨髓细胞有丝分裂染色体标本。
[实验材料和用品]
光学显微镜、离心机、天平、培养箱、电吹风；离心管、注射器、试管、试管架、剪刀、镊子、吸管、载玻片（冰水中预冷）
体重20～25克小白鼠、0.1%秋水仙素、2%柠檬酸钠、0.075 mol/L KCl、卡诺氏固定液（甲醇:冰乙酸＝3:1）、0.01 mol/L 磷酸缓冲液、吉姆萨（Giemsa）母液.
实验十三 细胞减数分裂的观察
[目的要求]
观察生殖细胞减数分裂过程，掌握减数分裂分期和相应特征。
[实验原理]
有性生殖过程中，来自父本和母本的配子相互结合形成合子，合子发育成为后代个体。减数分裂是有性生殖细胞形成过程中的一种特殊有丝分裂，生殖母细胞的染色体复制一次，而细胞连续分裂两次，从而形成四个单倍体的子细胞。经过减数分裂，配子中的遗传物质减半，从而确保了受精后的合子中遗传物质数量的稳定性，同时，减数分裂过程中的发生的染色体交叉和互换，有利于增加后代的变异性，确保了后代的多样性和适应环境变化的能力。
[实验内容]
用明视野显微镜对玻片标本进行观察，先用低倍镜寻找目标，再用高倍镜观察细节。
[实验材料和用品]
明视野显微镜；玉米花药细胞压片（示减数分裂各阶段）。
实验十四 DNA的细胞化学检测
[目的要求]
学习细胞DNA的孚尔根染色。
[实验原理]
在细胞学研究中，我们不仅要对细胞内某种组分，如多糖、脂质、核酸和蛋白质进行定性分析，常常还要对其进行定位和定量分析，这就属于细胞化学（cytochemistry）的研究范畴。细胞化学是指在保持细胞原有形态结构的基础上，利用物理的、化学的或者免疫学的方法，原位显示某种物质的分布和含量，从而研究与其相关的机能活动的科学。
细胞化学的研究对象除了糖类、脂类、核酸、蛋白质（酶）外，还包括生物胺、特异抗原、无机盐和微量元素等。按照其研究对象不同，可分为糖类细胞化学、脂类细胞化学、蛋白质（酶）细胞化学、核酸细胞化学等。随着生命科学的发展和研究技术的进步，细胞化学同荧光显微技术、电镜技术、电子计算机技术、流式分选技术、免疫学和分子生物学技术相结合，已经逐步演变成为一个新的研究和技术领域——现代细胞化学。
一般来说，细胞化学反应的原理是利用某些试剂能够与待测物质的特有基团发生特异性结合，从而通过细胞中该试剂存在的部位和颜色（沉淀）的深浅，间接地显示出待测组分的分布和含量。例如，多糖能被过碘酸（HIO4）氧化产生多醛基，当醛基与Schiff试剂结合后会生成紫红色反应产物，此即PAS反应（periodic acid Schiff reaction），该反应阳性的部位即表示有多糖组分的存在[Hotchkiss,McManus1948]；检测脂质常用脂溶性染料，如苏丹Ⅳ和苏丹黑等，脂质分别会被染成红色和黑色，或者利用四氧化锇也可以使不饱和脂肪酸还原产生黑色；在检测核酸时，可将脱氧核糖核酸用盐酸进行脱嘌呤处理，其暴露出的自由醛基可与Schiff试剂发生反应呈现紫红色，该反应被称为Feulgen反应[Feulgen,1924]，不仅可以特异显示DNA的分布，而且能对细胞核内的DNA进行定量分析，是细胞化学中的经典实验之一；检测蛋白质的方法较多，除Millon反应、重氮反应等经典的细胞化学方法外，还有特异性更强的免疫荧光、免疫酶标和免疫电镜等技术。
[实验内容]
植物细胞的孚尔根染色。
[实验材料和用品]
酸性磷酸酶工作液、2%硫化铵溶液、福尔马林-钙固定液；
光学显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、吸管、载玻片、盖玻片、小培养皿、小染色缸、剪刀、镊子、酒精灯、吸水纸。
四、教材与参考书
教 材：刘江东 赵刚 邓凤姣 马文涛 邱金凤 余其兴，细胞生物学实验教程（第一版），武汉大学出版社，2005年
参考书：[1] 翟中和，王喜忠，丁明孝.细胞生物学，高等教育出版社，2000
[2]王金发.细胞生物学，科学出版社，2003
[3]李素文.细胞生物学实验指导，高等教育出版社，施普林格出版社，2001
[4]程宝鸾.动物细胞培养技术，华南理工大学出版社，2001
[5]薛庆善.体外培养的原理与技术，科学出版社，2001
[6]赵刚，刘建中.医学细胞生物学实验与习题，科学出版社，2001
[7]马文涛，邓凤姣，张晴川.细胞生物学实验讲义，武汉大学生命科学学院，2003
[8]辛华.细胞生物学实验，科学出版社，2001
[9]杨汉民.细胞生物学实验（第二版），高等教育出版社，1997
[10]郝水.有丝分裂和减数分裂，高等教育出版社，1982
[11]David L. Spector, Robert D.Goldman, Leslie A.Leinwand. Cells: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1998
五、考核方式
实验报告、实验操作、口试、其他（考勤、值日等）。
