分子生物学实验课程教学大纲

开课院系：生命科学学院

授课对象：本科生

课程学分：1.5

课程学时：48

授课教师：（负责人）

姓名：毛歆

邮箱：xinmao@whu.edu.cn

第一章 分子生物学实验课程简介、

1.DNA 重组技术发展历史；

2.分子生物学的主要研究研究方法；

3.DNA 重组技术的应用；

4.课程内容和要求

5.仪器使用和材料准备。

第二章 质粒 DNA 的提取及纯化及电泳检测

1.含目的质粒（pEGFP-N3、pET28a）的菌体收集；

2.碱裂解法提取质粒 DNA；

3.纯化质粒 DNA；

4.琼脂糖凝胶电泳检测；结果观察、照相。

第三章 质粒 DNA 的小量酶切、电泳检测及大量酶切

1.限制性内切酶

2.常用酶的选用和保存

3.单、双酶切原理；

4.质 粒 DNA （ pEGFP-N3 、 pET28a ） 小 量 酶 切

（BamHI/XhoI）

5.电泳检测小量酶切结果及大量酶切。

第四章 目的 DNA 片断的回收

1.低熔点琼脂糖法回收 DNA

2.玻璃粉法回收 DNA

3.质粒载体及酶切目的片段电泳、

4.DNA 片段回收及纯化

5.DNA 定量

第五章 回收 DNA 片断的鉴定及 DNA 重组（连接反应）

1.电泳分离目的基因 DNA 片段及载体片段；

2.玻璃粉法回收目的基因 DNA 片段及载体片段；

3.电泳检测回收产物并定量；结果观察、照相；

4.DNA 重组连接反应的建立。

第六章 感受态细胞的制备及连接产物的转化

1.CaCl₂ 法制备感受态细胞；

2.连接产物的转化；

4.荧光蛋白创意划平板；结果观察、照相；

5.挑取 3 个阳性克隆菌落并培养；

6.观察结果，分别收集菌体置冰箱储藏，并进行转化率计算。

（第二天）

第七章 菌落 PCR 法重组克隆子的鉴定.

1.PCR 技术原理、引物设计原则；PCR 体系建立及污染防范

2.3个阳性克隆菌落进行 PCR 鉴定；穿插介绍蓝白斑筛选的原理

3.PCR 产物的电泳检测及结果观察。

第八章 酶切法鉴定重组克隆子

1.PCR 结果阳性的菌落培养物进行质粒的提取（试剂盒）

2.双酶切鉴定（BamHI/XhoI）

3.电泳检测

第九章 BL21 感受态细胞的制备及重组质粒的转化

1.CaCl₂ 法制备感受态细胞；

2.重组质粒的转化；

3.转化平板观察；结果观察、照相。（第二天）

第十章 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化

1.IPTG 诱导表达绿色荧光蛋白；

2.最佳蛋白收获时间的确定；

3.蛋白样品的制备。

第十一章 绿色荧光蛋白的纯化

1.大量菌体培养收集；

2.菌体裂解；

3.镍柱法纯化绿色荧光蛋白蛋白。

第十二章 诱导表达蛋白的 SDS-PAGE 电泳检测

1.SDS-PAGE 电泳凝胶分离胶和浓缩胶制备；

2.纯化蛋白样品制备；

3.诱导表达蛋白样品电泳检测；

4.凝胶染色和脱色；结果观察、照相。（第二天）